الفهرس 
IntroductionOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 145 |  |  |
| | | from | 145 | | |
Abstract
هدفت الرسالة إلى دراسة التحول البيولوجي الميكروبي لحمض الكافييك بواسطة بعض فصائل الكانديدا باستخدام بروتوكول التخمير المرحلي. تم جمع عدد ٩٢عزلة سريرية من سلالة الكانديدا وعمل مسح لتحديد العزلات ذات القدرة على تحويل حمض الكافييك. أجريت تجارب دراسة التحول البيولوجي في قوارير حجمها ٢٥٠ ملليميتر و تحتوي على٥٠ ملليميتر من وسط مستخلص الخميرة و فول الصويا مع نسبة ٢٪ وزن/حجم من الجلوكوز وضبط درجة الاس الهيدروجيني الى ٧ و كان حجم اللقاح المستخدم ١٠ % حجم/حجم وتم ضبط درجة حرارة الحضانة عند ٢٨ درجة مئوية وسرعة الاهتزازعند ٢٥٠ لفة في الدقيقة. تم اضافه حمض الكافييك بعد٢٤ ساعه و تركت القوارير تحت نفس الظروف لمدة ٧٢ ساعه. وبعد انتهاء فترة الحضانة تم فصل الوسط خالي من الخلايا ومزجة مع خليط من خلات الإثيل والبيوتانول (٩:١) ثم فصل الطبقة العضوية وتبخيرها للحصول على مستخلص جاف. استخدم الميثانول لإذابة المستخلصات الجافة لدراسة التحول الحيوى لحمض الكافييك باستخدام تقنية الكروماتوجرافي والرنين المغناطيسي النووى. واثناء إجراء التحليلين (الكروماتوجرافي والرنين المغناطيسي النووي) استخدم عينات من حمض الكافييك والوسط المستخدم ومستخلص الميثانول من وسط نموالسلالات دون اضافة حمض الكافييك كمرجعية لمقارنتها مع نتائج تحليل العينات المختبرة.
أظهرت نتائج الكروماتوجرافي أن سبع عزلات ( CI-2 و CI-4 و CI-9 و CI-14 و CI-24 و CI-61 و CI-107) تمكنت من تحويل حمض الكافييك وأعطيت نمطًا مختلفًا من الفصل الكروماتوجرافى. وقد تم التوصل لنفس النتائج بإستخدام الرنين المغناطيسي النووى حيث كشفت الأطياف التي تم الحصول عليها أن العزلات السبعة لديها القدرة على التحويل الحيوي لحمض الكافييك. بالنسبة لمستخلص CI-24 اكددت نتائج التحليل بإستخدام الرنين المغناطيسي ظهور إشارات طيفية جديدة مع اختفاء إشارات حمض الكافييك. وفيما يخص مستخلص CI-9 اظهرت النتائج وجود إشارات حمض الكافييك مع تغيير طفيف في قيم التحول الكيميائي. اضافة الى ذلك أظهرت النتائج تحللًا كاملاً لحمض الكافييك في العينات الخاصة بالمستخلصات CI-2 و CI-4 وCI-14 وCI-61 و CI-107.
استكملت الدراسة بعمل تجارب إضافية لتقييم النشاط البيولوجي (المضاد للأكسدة، ومضاد الميكروبات، والسام للخلايا السرطانية) لمستخلصات العزلات السبعة المختارة. وقد تم تقييم النشاط المضاد للأكسدة بطريقة الكسح الجذري، حيث تم استخدام حمض الكافييك وحمض الأسكوربيك كضوابط للمقارنة وتم قياس الامتصاصية عند ٥١٧ نانومتر. تم حساب سعة الكسح الجذري (٪) لكل مستخلص والضوابط المستخدمة. وقد أظهرت النتائج أن جميع المستخلصات لديها نشاطات مضادة للأكسدة ولكن بمستويات أقل مقارنة بحمض الكافييك.ماعدا مستخلص CI-61 أظهر نشاط مقارب لنشاط حمض الكافييك.
تم إجراء المزيد من الدراسات لتقييم الأنشطة المضادة للبكتيريا وللفطريات وللفيروسات علي المستخلصات الخاصة بالعزلات المختارة. وقد اظهرت النتائج أن المستخلصات CI-61 و CI-4 و CI-9 و CI-24 لها درجات مختلفة من النشاط المضاد للبكتيريا ، في حين أن المستخلصات الأخرى ليس لها نشاط ملحوظ ضد البكتريا. من ناحية أخرى لم تُظهر المستخلصات أي نشاط ملحوظ مضاد للفطريات أوالفيروسات المستخدمة في هذه الدراسة. بالإضافة إلى ذلك ، تم تقييم النشاط السام للخلايا السرطانية للمستخلصات المختارة وذلك ضد الخلايا Caco-2 و MCF-7 وHepG2 باستخدام الطريقة اللونية MTT. و قد أظهرت النتائج ان المستخلصات CI-24 و CI-2 و CI-107 لها نشاطًا واعدًا ضد خط خلايا Caco-2. ووفقًا للنتائج التي تم الحصول عليها ، فإن العزلة CI-24 كانت ذات نشاط سام لخلايا سرطان القولون والمستقيم بالإضافة إلى نشاطها الواعد المضاد للبكتيريا ولذلك تم اختيارها لاجراء المزيد من الدراسات.
تم تعريف العزلة CI-24 وراثيا باسم Candida albicans (رمز الالتحاق MH356583) باستخدام تحليل الجين 28S rRNA. وتم استخدام تقنيات التحليل الطيفي بهدف التعريف الهيكلي للمركبات الناتجه من عمليه التحول البيولوجي لحمض الكفاييك باستخدام المستخلص الخاص بالعزلة CI-24. وقد كشفت نتائج التحليل الطيفي لمستخلص الميثانول قدرة العزلة CI-24 على تحويل حمض الكافييك إلى حمض بارا-هيدروكسي بنزويك وصيغته الجزيئية C7H6O3 والوزن الجزيئي: ١٣٨.
وخلال الدراسة تم تحسين النشاط البيولوجي لسلالة CI-24 لتحويل حمض الكافييك بمقدار٨,٢اضعاف من خلال التطفير الوراثي باستخدام أشعة جاما بجرعة 5 كيلو جراي والتي ادت إلى قتل ٩٩,٩٩٪ من الخلايا المستخدمة. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام منهجية استجابة السطح لتحسين نشاط سلالة CI-24 لعملية التحول البيولوجي لحمض الكافييك. وعند تطبيق النموذج، تم الحصول على القيمة القصوى لتركيز ٤۷,۷ميلليجرام من حمض بارا-هيدروكسي بنزويك) في وسط التخمر المستخدم يحتوي على خلاصة الخميرة (١ ٪وزن/حجم) كمصدر نيتروجين مع ضبط درجة الحموضة الي ٦,٦ والاهتزاز عند ٢٥٠ لفة في الدقيقة ودرجة حرارة الحضانة عند ٢٨ درجة مئوية . بشكل مجمع ، أدي التطفير الوراثي باستخدام أشعة جاما والتحسين المعتمد على النماذج للعوامل الفسيولوجية والبيئية بزيادة قدرة التحول البيولوجي للسلالة المختبرة (CI-24) بمقدار ۷,٥ أضعاف مقارنة بالسلالة الأصلية باستخدام الظروف الأصلية. وأخيرا تم تحسين كفاءة التحول البيولوجي من قبل العزلة المختارة CI-24 عن طريق تثبيت الخلايا في حبات مخلقة من مادة ألجينات الكالسيوم، حيث ظلت الخلايا المثبتة نشطة بنفس الكفاءة لثلاثة استخدامات متكررة.