Search In this Thesis
   Search In this Thesis  
العنوان
Molecular and physiological studies on transformation of Vicia faba L. to enhance tolerance to salt stress \
المؤلف
Ali, Hanan Samir Salah El- Din.
هيئة الاعداد
باحث / حنان سمير صلاح الدين علي
مشرف / رئيفة أحمد حسنين
مشرف / حنان أحمد هاشم
مشرف / أحمد أحمد أحمد القزاز
تاريخ النشر
2018.
عدد الصفحات
179 p. :
اللغة
الإنجليزية
الدرجة
الدكتوراه
التخصص
علوم النبات
تاريخ الإجازة
9/9/2018
مكان الإجازة
جامعة عين شمس - كلية العلوم - النبات
الفهرس
Only 14 pages are availabe for public view

from 179

from 179

Abstract

أجريت هذه الدراسة بقسم التكنولوجيا الحيوية النباتية، شعبة الهندسة الوراثية والبيوتكنولوجيا ، المركز القومي للبحوث، القاهرة، مصر، و بقسم علم النبات، كلية العلوم، جامعة عين شمس، خلال الفترة 2012-2017, وكان الهدف من هذه الدراسة إنتاج نباتات الفول البلدي المعدلة وراثيا معمليا عن طريق نقل جين ATNHX1 بالاجروبكتيريوم لتحمل صفة مقاومة الملوحة كاجهاد غير حيوي.
ويمكن تلخيص هذه الدراسة على النحو التالي:
1. استيلاد النباتات:
- تم تطوير نظام الاستيلاد المباشر باستخدام البراعم الطرفية لأصناف الفول البلدي الثلاثة: مصر 1، جيزة 40، جيزة843
- وجد أن أعلى نسبة نمو خضري (90.54٪) مع صنف جيزة 40 يليه مصر 1 (83.783٪) ثم جيزة 843 ( 82.432٪)
- بالنسبة لتكوين الجذور، فقد وجد أن نسبة ( 100٪) قد سجلت مع الأصناف الثلاثة تحت الدراسة.
- فيما يتعلق بطول الجذر، كان الأطول (20.573 سم) مع صنف جيزة 843، يليه مصر 1 (20.377 سم) ثم جيزة 40 (19.925 سم)
- وللحصول على نباتات متطورة من الأصناف الثلاثة، فقد تم استزراعها على نفس بيئة التجذير في أواني مخروطية (1000 مل، ثم 2000 مل) والتثبيت بعصا خشبية لمدة ستة أسابيع.
2. النقل الجيني:
- تم معاملة القطع الساقية المفصولة من الأصناف الثلاثة النامية معمليا بالأجروباكتيريوم والتي تحتوي على بلازميد pGII0229MASnhx1 والذي يحتوي على جينATNHX1.
- النباتات التي أجريت عليها عملية التحول الوراثي كانت نامية على بيئة MS تحتوي على فيتامينات B5 + 2 ملجم/لتر بنزيل أمينو بيورين و ثياديازورون +300 ملجم/لتر الحمض الأميني سستين +0.02 جم/لتر نترات الفضه , 1جم/لتر فحم نباتي نشط+ 300 ملجم/لتر cefotax+ 1.5 ملجم/لتر PPT.
- وقد تم الحصول على أعلى كفاءة نقل جيني (4.16٪) مع صنف جيزة 40 يليه مصر 1 (3.5٪) ثم جيزة 843 (2.62٪).
3. التأكيد الجزيئي للنباتات المعدلة وراثيا:
3.1. تحليل تفاعل البلمره المتسلسل ((PCR:
تم عزل الحمض النووي الجيني الكلي من أوراق النباتات المنتخبة. وتم إجراء تحليل البلمره المتسلسل للاستدلال على وجود جين ATNHX1 (bp 808( و جين bar (260 bp)في النباتات المعدلة وراثيا و البلازميد ولم يستدل على وجود هذه الجينات في النباتات غير المعدله وراثيا.
3.2. تقنية ال Western blot وتحليل Real-time PCR:
أظهر تحليل ال Western blot وجود بروتين بكتلة جزيئية KDa59.5 وتم تأكيد هذا البروتين ليكون الخاص بجين AtNHX1، لأنه تم التعرف عليها من قبل الأجسام المضادة ل AtNHX1 في النباتات المعدلة وراثيا.
وباستخدام RT-PCR لخطوط الفول المعدلة وراثيا وجد أن AtNHX1 تم نسخه تحت كل من الظروف العادية و الإجهاد بالملح. ومع ذلك، زيادة التعبير كانت مرتبطه مع تركيزات الملح, على سبيل المثال، كان التعبيرعن AtNHX1 1382-، 929- و 223 ضعف في الجيزة 40، مصر 1 والجيزة 843 المعامله ب 200 ملي مول كلوريد الصوديوم بالمقارنة مع النباتات المعالجة مع 0 ملي مول كلوريد الصوديوم. ولم تظهر النباتات الغير معدلة وراثيا اي وجود للجين او تعبيره
4. تقييم مقاومة الملوحة في الفول البلدي المعدل وراثيا:
تم تقييم استجابة نباتات الفول البلدي ( عمر شهرين) المعدلة وراثيا وغير المعدلة وراثيا لملح كلوريد الصوديوم من خلال تحديد الكتلة الحيوية، والأصباغ التمثيلية، والبرولين، والبروتين الكلي القابل للذوبان، وبيروكسيد الدهون، ونشاط مضادات الأكسدة والفينولات الكلية والمحتوى المعدني (Na+, K+ and Na+/K+ ratio) بعد أربعة أسابيع من التعرض لتركيزات مختلفة من الملح.
4.1. معايير النمو (الكتلة الحيوية والجافه للنموات الخضرية والجذور):
- أوضحت النتائج أن الكتلة الحيوية والجافه للنموات الخضرية للنباتات المعدلة وراثيا أعلى من تلك غير المعدلة وراثيا.
- بالمثل, كانت الكتلة الحيوية لجذور النباتات المعدلة وراثيا أعلى من تلك غير المعدلة وراثيا.
- كلا من النباتات المعدلة وغير المعدلة وراثيا أظهرت فروقا معنوية في استجابتها (P<0.0001 ( ما بين كل المعاملات موضحة وجودعلاقة بين التعبير الجيني للجين AtNHX1 والكتلة الحيويه (الطازج و الجاف).
- التحول الوراثي بجين AtNHX1 هو أكثر فعالية لتحمل الاجهاد الملحي في صنف مصر1 مقارنه بصنفي جيزه 40 و جيزه 843, وذلك وفقا للفرق بين الكتلة الحيوية (طازج و جاف) للنباتات المعدلة وغير المعدلة وراثيا.
4.2. صبغات التمثيل الضوئي:
- أوضحت النتائج أن صبغات التمثيل الضوئي ( كلوروفيل a, كلوروفيل b و الكاروتينيدات) انخفضت انخفاضا معنويا استجابة لزياده معدل الملوحة في النباتات مقارنة بمعاملة الكنترول.
- النباتات المعدلة وراثيا (نموات خضرية) أظهرت محتوى أعلى من صبغات التمثيل الضوئي مقارنة بتلك غير المعدلة وراثيا.
- بصفة عامة, وجد أن أعلى محتوى صبغات تمثيل غذائي كان مع نباتات الصنف جيزه 40 يليه مصر 1 ثم جيزه 843.
4.3. محتوى البرولين:
- وجد أن, محتوى البرولين زاد في كل من النباتات المعدلة وراثيا والكنترول بزيادة تركيز ملح كلوريد الصوديوم بينما كان محتوى البرولين في النباتات المعدلة وراثيا مرتفعا ارتفاعا معنويا (P<0.0001 ) بتلك غير المعدلة وراثيا.
- بصفة عامة, وجد أن أعلى محتوى للبرولين كان مع نباتات الصنف جيزه 843 يليه جيزه 40 ثم مصر 1 ذلك لكلا من النموات الخضرية و الجذور.
4.4. محتوى البروتين الذائب الكلي:
- أوضحت النتائج وجود زيادة في البروتين الذائب الكلي مع زيادة تركيزات ملح كلوريد الصوديوم.
- وكانت هناك فروق معنويه (P<0.0001) بين النباتات المعدلة وغير المعدلةوراثيا.
- بصفة عامة, وجد أن أعلى محتوى للبروتين الذائب الكلي كانت مع صنف جيزه 40 يليه مصر 1 ثم جيزه 843 بالنسبة لكل من النموات الخضرية و الجذور.
4.5. محتوى بيروكسيد الدهون:
- أوضحت النتائج أن محتوى بيروكسيد الدهون (المالونداي الدهيد) لكل من النباتات المعدلة وغير المعدلة وراثيا للأصناف الثلاثة تزيد مع زيادة تركيزات ملح كلوريد الصوديوم.
- محتوى بيروكسيد الدهون أقل في النباتات المعدله وراثيا (46.3%, 38.5% and 34.5%) لجذور أصناف مصر 1 وجيزه 40 وجيزه 843 على التوالي عند معاملتها ب 200 ملي مول مقارنة بالنباتات الكنترول التي تعرضت لنفس المستوى من الاجهاد الملحي.
- بصفه عامه, أقل محتوى لبيروكسيد الدهون وجد مع صنف جيزه 40 يليه مصر1 ثم جيزه 843 لكلا من النموات الخضرية و الجذور.
4.6. نشاط مضادات الأكسدة الكلية:
- أوضحت النتائج أن النباتات المعدلة وراثيا بجين AtNHX1 أظهرت زيادة معنويه في نشاط مضادات الأكسدة الكليه (DPPH- scavenging assay %) مقارنة بنباتات الكنترول المعرضه لنفس تركيز ملح كلوريد الصوديوم.
- بصفة عامة, لوحظ أن أعلى نشاط لمضادات الأكسدة كا مع جيزة 40 يليه جيزه 843 ثم مصر1 لكلا من النموات الخضرية والجذور مع وجود فروق معنويه بين النباتات المعدلة وغير المعدلة وراثيا.
4.7. محتوى الفينولات الكلية:
- أوضحت النتائج أن تراكم الفينولات الكلية في النموات الخضرية والجذور للنباتات المعدلة وراثيا بجين AtNHX1 أعلى منها في تلك النباتات من معاملات الكنترول.
- بصفة عامه, وجد أن أعلى محتوى للفينولات الكليه كان مع نباتات صنف جيزه 40 يليه مصر1 ثم جيزه 843 مع وجود فروق معنوية بين النباتات المعدلة وغير المعدلة وراثيا.
4.8. تقدير الصوديوم و البوتاسيوم و النسبة بينهما:
- تحت الظروف العادية والاجهاد الملحي وجد أن النباتات المعدلة وراثيا بجين AtNHX1 كانت أعلى في مستويات الصوديوم وأقل في مستويات البوتاسيوم مقارنة بتلك النباتات غير المعدلة وراثيا.
- كل مستويات الملوحة زادت من نسبة الصوديوم/ البوتاسيوم في كلا من النموات الخضرية والجذور في النباتات المعدلة وراثيا مقارنة بالكنترول. وكانت نسبة الصوديوم / البوتاسيوم في النموات الخضرية المعدلة وراثيا أعلى منها في جذور تلك النباتات.
- بصفة عامة, وجد أن نسبة الصوديوم / البوتاسيوم كانت مع صنف جيزه 843 يليه جيزه 40 ثم مصر 1 وذلك بالنسبة للنموات الخضريه, في حين كانت النسبة أعلى مع صنف جيزه 40 يليه جيزه 843 ثم مصر1 بالنسبة للجذور مع وجود فروق معنويه بين النباتات المعدلة وغير المعدلة وراثيا.