الفهرس 
LIST OF CONTENTSOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 142 |  |  |
| | | from | 142 | | |
Abstract
أجريت الدراسة الحالية بقسم الكيمياء الحيوية بكلية الطب البيطري جامعة بنها لبحث الفرصة العلاجية للجيلاتين – حمض الأكريليك – 5- فلورويوراسيل النانونية في علاج السرطان، وتم إجراء تشعيع جاما للبوليمر/ المونومر في محلول مائي من خلال خلايا جاما 60Co في المركز القومي لبحوث وتكنولوجيا الإشعاع، هيئة الطاقة الذرية المصرية.
تم فحص الخصائص المورفولوجيه لمركب الجيلاتين – حمض الاكريلك 5- فلورويوراسيل النانونيه باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ .وتم استخدام تشتت الضوء الديناميكي في فحص عينة الجيلاتين – حمض الاكريلك 5- فلورويوراسيل النانونيه ، وتم استخدام محلل الجسيمات ZetaSizer Nano ZS لفحص توزيع حجم الجسيمات. بالإضافة إلى ذلك، تم تقدير حساسية الرقم الهيدروجيني للناوجيل باستخدام كل من تشتت الضوء الديناميكي وZetaSize. علاوة على ذلك، تم التاكد من تحرر 5- فلورويوراسيل والثبات الكيميائي للنانوجيل عند 266 نانومتر نتيجةً التغير في الرقم الهيدروجيني باستخدام التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية والمرئية. و من خلال استخدام خلايا HCT 116 (خلايا سرطان القولون البشري) تم تحديد الجرعه الممينه الوسطيه للنانوجيل .
تم استخدام عدد 60 ذكرا من الجرذان (100 - 120 جم) في هذه الدراسة. تم تقسيم الجرذان إلى ست مجموعات رئيسية على النحو التالي:
المجموعة الأولى: (الضابطه): الجرذان العادية كانت بمثابة مجموعه التحكم.
المجموعة الثانية : (مجموعة ثنائي ميثيل الهيدرازين): تم حقن الجرذان بـ ثنائي ميثيل الهيدرازين 20 مجم/كم من وزن الجسم تحت الجلد مره اسبوعيا لمدة 8 اسابيع وتعريضها للأشعة تحت الحمراء للحث على حدوث خلل في انسجة القولون.
المجموعة الثالثة: (5- فلورويوراسيل): حيث أعطت الجرذان 5- فلورويوراسيل 12.5 مجم/كم من وزن الجسم ثلاث مرات أسبوعياً عن طريق الحقن داخل الصفاق لمدة شهر واحد.
المجموعة الرابعة: (الجيلاتين – حمض الاكريلك 5- فلورويوراسيل النانويه): حيث أعطت الجرذان الجيلاتين – حمض الاكريلك 5- فلورويوراسيل النانويه 2.5مجم/كم من وزن الجسم ثلاث مرات أسبوعياً عن طريق الحقن داخل الصفاق لمدة شهر واحد.
المجموعة الخامسة : (ثنائي ميثيل الهيدرازين + 5- فلورويوراسيل ): حيث تم حقن الجرذان بـ ثنائي ميثيل الهيدرازين مثل المجموعة الثانية ثم تم علاجها باستخدام 5 - فلورويوراسيل 12.5 مجم/كم من وزن الجسم ثلاث مرات أسبوعياً عن طريق الحقن داخل الصفاق لمدة شهر واحد.
المجموعة السادسة: (ثنائي ميثيل الهيدرازين + الجيلاتين – حمض الاكريلك 5- فلورويوراسيل النانويه ): حيث تم حقن الجرذان بـ ثنائي ميثيل الهيدرازين مثل المجموعة الثانية ثم تم علاجها باستخدام الجيلاتين – حمض الاكريلك 5- فلورويوراسيل النانويه 2.5 مجم/كم من وزن الجسم ثلاث مرات أسبوعياً عن طريق الحقن داخل الصفاق لمدة شهر واحد.
جمع عينات الدم وأنسجة القولون والكبد:
في نهاية التجربة، تم ذبح جميع الجرذان وجمعت عينات الدم عن طريق ثقب القلب وفقًا للمجلس الأخلاقي المؤسسي لرعاية الحيوان واستخدامه (BUFVTM 04-04-22) وتم استخدام المصل الناتج لمزيد من التقديرات البيوكيميائية: نشاط انزيمات (AST )ِAspartate transaminase و ( Alanine transaminase (ALT. تم فصل أنسجة القولون والكبد على الفور، وغسلها بمحلول ملحي فسيولوجي بنسبة 0.9٪ وتقسيمها إلى قسمين. تم تخزين الجزء الأول عند -80 درجة مئوية لمزيد من التحاليل.
تم استخدام انسجة القولون في :
• تقدير مستوى LC3-II، NFkB، وTLR2.
• التعبير الجيني لكلا من
PI3K, Becline 1, ATG7, AKT, mTOR, AMPK, P62, Caspase 9, Caspase3, Bcl2 و Bax
تم استخدام انسجة الكبد في :-
• تقدير دلالات الإجهاد التأكسدي: SOD وMDA وGSH
• التعبير الجيني لكلا من :
IL-1β ، TNF-α ، Bax ، Caspase3 ، HO-1 ،Nrf2 وKEAP1.
بينما تم استخدام الجزء الثاني من أنسجة الكبد والقولون لإجراء الفحوصات النسيجيه: تم تثبيت عينات القولون والكبد في 10٪ من محلول الفورمالين ثم وضعها في البارافين وتقسيمها بسمك 5-6 ميكرومتر. بعد ذلك تم صبغ هذه المقاطع باستخدام الهيماتوكسيلين يوزين (H&E). تم تحليل الشرائح المجهرية. علاوة على ذلك، تم دراسة الكشف عن عن بروتين Ki-67 و Caspase3 بواسطة الكيمياء المناعية في أنسجة القولون.
ويمكن تلخيص نتائج هذه الدراسة على النحو التالي:
1- القولون:
دلالات الانتشار:
أظهر انسجة القولون زيادة ملحوظة في مستويات TLR2 و NFkβ في المجموعة المعالجة بـ ثنائي ميثيل الهيدرازين بالمقارنة مع مجموعة الضابطه. ومع ذلك، فإن العلاج بـ 5- فلورويوراسيل أو 5- فلورويوراسيل نانوجيل قلل بشكل كبير من مستويات TLR2 وNFkβ بالمقارنة مع مجموعة ثنائي ميثيل الهيدرازين . أيضًا، أظهرت الدراسة الحالية أن 5- فلورويوراسيل نانوجيل لها تأثير فعال من 5- فلورويوراسيل في العلاج.
مسار إشارات PI3K/AKT/mTOR:
تم زيادة التعبير الجيني لـ PI3K و AKT و mTOR بشكل ملحوظ في المجموعة المعالجة بـ ثنائي ميثيل الهيدرازين بالمقارنة مع مجموعة الضابطه. في المقابل، أظهرت المجموعات التي عولجت بـ 5- فلورويوراسيل أو 5- فلورويوراسيل نانوجيل انخفاضًا ملحوظًا في التعبير الجيني لـ PI3K وAKT وmTOR بالمقارنة مع مجموعة ثنائي ميثيل الهيدرازين . وقد لوحظ بوضوح أن 5- فلورويوراسيل نانوجيل له تأثير قوي في العلاج.
دلالات الالتهام الذاتي:
أظهرت المجموعة المعالجة بـ ثنائي ميثيل الهيدرازين تثبيط منظمات الالتهام الذاتي بما في ذلك مستوى البروتين لـ AMPK وmRNA و Beclin 1 وTAG7 بالإضافة إلى مستوى LC3 II بالاضافه الي زيادة في التعبير الجيني لـ P62 بالمقارنة مع مجموعة الضابطه. على العكس من ذلك، أدى العلاج باستخدام 5- فلورويوراسيل أو 5- فلورويوراسيل نانوجيل ادي إلى زيادة مستوى بروتين AMPK وLC3II بالإضافة إلى التعبير الجيني لـ ATG7 وBecllin 1 وانخفاض مستوى P62 بالمقارنة مع مجموعة ثنائي ميثيل الهيدرازين . كان تأثير 5- فلورويوراسيل نانوجيل أفضل بشكل واضح من 5 - فلورويوراسيل بمفرده.
دلالات موت الخلايا المبرمج:
أظهر ثنائي ميثيل الهيدرازين انخفاضًا ملحوظًا في مستوى بروتين Bax المؤيد للموت المبرمج وزيادة كبيرة في مستوى البروتين BCL2 المضاد للموت المبرمج عند مقارنته مع المجموعة الضابطه. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت النتائج تثبيط نشاط كل من caspase 3 & 9 بشكل ملحوظ في المجموعة المعالجة بـ ثنائي ميثيل الهيدرازين بالمقارنة مع مجموعة الضابطه. من ناحية أخرى، أدت المعاملة بـ 5- فلورويوراسيل أو 5- فلورويوراسيل نانوجيل إلى زيادة مستوى بروتين Bax وانخفاض مستوى BCl2 مع زيادة معنوية في نشاط caspase 3 & 9 بالمقارنة مع مجموعة ثنائي ميثيل الهيدرازين .
الفحوصات النسيجية:
لوحظ وجود خلل وتغير ملحوظ في نسيخ خلايا القولون مع ظهور العديد من الخلايا الالتهابيه في مجموعه ثنائي ميثيل الهيدرازين عند مقارنتها بالمجموعه الضابطه. بينما أدى العلاج بـ 5- فلورويوراسيل نانوجيل إلى تحسن ملحوظ في خلايا القولون التالفه بالمقارنه بمجموعه ثنائي ميثيل الهيدرازين.
2- الكبد :
تم زيادة نشاط ALT وAST بشكل ملحوظ في المجموعة المعالجة بـ ثنائي ميثيل الهيدرازين مقارنة بالمجموعة الضابطة. من ناحية أخرى، أظهرت مجموعة ثنائي ميثيل الهيدرازين+ 5 - فلورويوراسيل نانوجيل انخفاضًا في نشاط كل من ALT وAST بشكل أفضل من ثنائي ميثيل الهيدرازين+ 5 - فلورويوراسيل بالمقارنة مع مجموعة ثنائي ميثيل الهيدرازين. تم زيادة التعبير عن IL1β الكبدي بشكل كبير في المجموعة المعالجة بـ ثنائي ميثيل الهيدرازين. في المقابل، أظهرت مجموعة ثنائي ميثيل الهيدرازين+ 5 - فلورويوراسيل نانوجيل تأثيرًا قويًا من خلال تقليل التعبير عن IL1β مقارنة بمجموعة ثنائي ميثيل الهيدرازين+ 5 - فلورويوراسيل مقارنةً بمجموعة ثنائي ميثيل الهيدرازين. أظهر ثنائي ميثيل الهيدرازين انخفاضًا ملحوظًا في مستويات GSH وSOD، مع زيادة ملحوظة في مستوى MDA مقارنةً بالمجموعة الضابطة. أظهرت مجموعة 5 - فلورويوراسيل نانوجيل تأثيراً أفضل من 5 - فلورويوراسيل من خلال انخفاض مستوى ALT وAST مع زيادة مستوى GSH وSOD وانخفاض مستوى MDA بالمقارنة مع مجموعة الضابطه. أيضًا ، قام 5 - فلورويوراسيل بتنظيم التعبير الجيني لجينات Nrf2 و Keap-1 إلى جانب انخفاض ملحوظ في جين HO-1 الكبدي مقارنةً بالمجموعة الضابطة. علاوة على ذلك، أظهرت الجرذان التي تلقت 5 - فلورويوراسيل نانوجيل أيضًا زيادة كبيرة في التعبير الجيني الكبدي لـ Keap-1 وNrf2 وHO-1 مقارنة بمجموعة 5 - فلورويوراسيل. وأخيرًا أظهرت المجموعة التي تم حقنها بمجموعة 5 - فلورويوراسيل نانوجيل تأثيرًا قويًا أكبر من 5 - فلورويوراسيل في تقليل TNFα وIL1β وIL-6 عند مقارنتها بالمجموعة الضابطة.
الفحوصات النسيجية:
أظهرت كل من شرائح أنسجة الكبد في المجموعه الضابطه و5 - فلورويوراسيل نانوجيل البناء النموذجي لانسجه الكبد مفارنه بمجموعه و5 – فلورويوراسيل التي ادت الي تلف ملحوظ في انسجة الكبد من الدرجه الثالثة
كل هذه النتائج تدعم أن 5- فلورويوراسيل نانوجيل له إمكانات علاجية كعامل مضاد لسرطان القولون وكذلك يقلل من التأثير الجانبي للدواء على الأنسجة الأخرى.