الفهرس 
Concept of recombinant immunotoxinsOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 284 |  |  |
| | | from | 284 | | |
Abstract
الملخص العربي
يعد السم الخارجي-أ من أشرس الأليات الممرضة لبكتيريا السودوموناس أريجينوزا وذلك لقدرته علي نقل الأدنوزين الريبوزي و التسبب في وقف إنتاج البروتين داخل الخلايا. ينقل السم الخارجي أ الأدينوزين الريبوزي للديفساميد الموجود علي حواف عنصر الإستطالة الريبوسومي مما يوقف عملية التبادل للحمض النووي الريبوزي الناقل وبالتالي يعطل عملية إطالة سلسة البيبتيد مما يؤدي إلي موت الخلية. وتلك الخاصية جعلته من السموم المختارة أثناء عملية تصنيع السموم المناعية.
لذلك فإن هذه الدراسة قد قامت بفحص السم الخارجي-أ المستخرج من خلايا بكتيريا السودوموناس أريجينوزا السريرية علي نقل الأدينوزين الريبوزي بإستخدام نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد و 4-نيتروبنزيليدين أمينوغواندين وكذلك تأثير أشعة جاما علي فعاليته. والجدير بالذكر أن مركب ال4-نيتروبنزيليدين أمينوغواندين هو المركب المستقبل للأدينوذين الريبوزي بدلا من الإستخدام المعتاد لمستخلص جنين القمح والنيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد المشع. أيضا تناولت تلك الدراسة, إستنساخ تسلسل النيكليوتيد الجيني الذي يرمز للجزء الثالث من السم الخارجي-أ المسئول عن القدرة الإنزيمية للسم (المعروفة بأسم ال ب ي 24) بداخل البلاسميد (pET22b(+) ) لإنتاجه عبر خلايا الإيشيريشيا كولاي. بعد ذلك تم إختبار القدرة الإنزيمية للب ي 24 علي نقل الأدينوزين الريبوزي لل4-نيتروبنزيليدين أمينوغواندين وعلي خلايا سرطانية مختلفة مزروعة بالمعمل. علاوة علي ذلك, تم دراسة تأثير دمج العلاج الإشعاعي مع مستخرج ال ب ي 24 علي نمو وتكاثر خلايا الكبد السرطانية المزرعة بالمعمل.
في هذه الدراسة, تم جمع 40 عزلة سريرية من السودوموناس أريجينوزا من عينات القيح وتنقيتهم علي أجار السيتريمايد و تعريف بعض العزلات بإستخدام تحليل الحمض النووي الريبوزي. فحصت تلك العزلات من وجود الجين الرامز للسم الخارجي-أ بإستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل التقليدي. وأظهرت النتائح وجود هذا الجين في 32 عزلة و تم التأكد من هوية الجين المتكاثر بتكنولوجيا سانجر لتحليل تسلسل النيوكليوتيد. تم تصنيع ال4-نيتروبنزيليدين أمينوغواندين من أمينوغوانيدين بيكربونات و 4-نيتروبنزلدهيد. وتم تفاعل المركبان مع بعضهم والتأكد من هوية المادة الناتجة بإستخدام أليات التحليل الطيفي المختلفة (UV, FTIR, C13-NMR, (APCI, ESI . بعد ذلك أستخدم ال4-نيتروبنزيليدين أمينوغواندين ومركب نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد معا لقياس القدرة الإنزيمية للسم الخارجي-أ علي نقل الأدينوزين الريبوزي المستخلص من عزلات السودوموناس أريجينوزا.
لذا تم إستخلاص السم الخارجي-أ من عزلات السودوموناس أريجينوزا بإستخدام نظام الترشيح الغشائي. قبل إضافة ال4-نيتروبنزيليدين أمينوغواندين و نيكوتيناميد الأدينين لمستخلص السم الخارجي-أ, تمت معالجته بمادة ديثيوريثريتول لتفعيل وتنشيط قدرته الإنزيمية. وبعد خلط المواد ببعضها الأخر, تم قياس التغيرات التفاعلية عن طريق التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية وتقنية الفصل الكروماتوجرافي عالي الكفاءة. وقد لوحظ تغير في أقصي إرتفاع للطول الموجي الأقصي بعد تعرض ال 4-نيتروبنزيليدين أمينوغواندين لمستخلص السم الخارجي-أ. ذلك التغير في الطول الموجي الأقصي يشير لنقل الأدينوزين الريبوزي بالسم الخارجي-أ. أيضا ظهور قمم جديدة خلف قمة النيتروبنزيليدين أمينوغواندين بالكروماتوجرام يشير للتفاعل بينهم ونقل الأدينوزين الريبوزي من نيكوتيناميد الأدينين لل 4-نيتروبنزيليدين أمينوغواندين. كل من التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية و الفصل الكروماتوجرافي عالي الكفاءة أكد علي قدرة السم الخارجي الإنزيمية علي نقل الأدينوزين الريبوزي.
بعد ذلك, إستكشفت القدرة الإنزيمية للسم الخارجي-أ علي خلايا سرطان الرأس والرقبة المزروعة بالمعمل. أظهر الفحص السريع للسمية الخلوية بإستخدام السلفورودامين بأن تركيز 100 ميليغرام لكل مل تسبب بسمية خلوية مما أكد بذل القدرة الإنزيمية داخل الخلايا وتوقف إنتاج البروتين بداخلها مما أدي إلي موتها. تأثرت القدرة الإنزيمية للسم الخارجي-أ و تدهورت بالجرعات المخفضة من أشعة جاما وتباينت بإرتفاع قيمة التركيز المثبط للنمو بنسبة 50% وذلك لقدرة الأشعة الجامية علي إحداث تعديلات مؤكسدة بهيكل البروتين مما يأثر علي قدرته الإنزيمية. تسببت الجرعات المخفضة من أشعة جاما في حزف الأدنين بالتسلسل الجيني للسم الخارجي أ مما تسبب في تغير بالتسلسل الأميني للسم الخارجي-أ وخفض قدرته الإنزيمية.
و قد تم إختبار القدرة الإنزيمية للسم الخارجي-أ, تم إستنساخ تسلسل النيكلويتد الرامز بال ب ي 24 بداخل البلاسميد(( (pET22b(+ونقله داخل الإشيريشيا كولاي لإنتاجه بإستخدام الكلاسيم كلوريد والصدمة الحرارية. وتم نمو خلايا الإشيريشيا كولاي علي أطباق ال LB أجار التي تحتوي علي الأمبسيلن و تم التأكد من نجاح عملية الإستنساخ بإستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل للمستعمرات النامية علي الأطباق وتكسير البلازميدات المهجنة (pET22b(+)-PA 16/ PA 22) بإستخدام الإنزيمات و ظهور الب ي 24 بالهلام الكهربائي. إستخدم مركب إيزوبروبيلثيو- بيتا- جالاكتوزيد لبدء عملية التعبير الجيني داخل خلايا الإشيريشيا كولاي و إستخلاص ال ب ي 24. تم التأكد من عملية التعبير الجيني بخلايا الإشيريشيا كولاي عن طريق إستخدام هلام الدوديسيل كبريتات الصوديوم بولي أكريلاميد الكهربائي و الذي أظهر بروتين ال ب ي 24 عند الوزن الجزيئي الغرامي مقارب لالثلاثون كيلو دالتون.
وأيضا إختبرت القدرة الإنزيمية لمستخلص ال ب ي 24 علي خليط نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد و ال4-نيتروبنزيليدين أمينوغواندين كما ذكر سابقا بإشتخدام تحليلات طيفية مختلفة و وتقنية الفصل الكروماتوجرافي عالي الكفاءة. أظهر مستخلص ال ب ي 24 القدرة علي نقل الأدينوزين الريبوزي من خلال علو الطول موجي الأقصي وظهور قمم جديدة بالكروماتوجرام. أيضا أثبت التحاليل الطيفية وقوع التفاعل و نقل الأدينوزين الريبوزي لخليط نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد و ال4-نيتروبنزيليدين أمينوغواندين. ومما أثار الإهنمام هي القدرة الإنزيمية العالية لمستخلص ال ب ي 24 التي قد تنسب إلي حذف الأجزاء المتسببة في إعاقة ستيريكية و هم المحالات البروتين أ و ب. بشكل مماثل لما سبق, أثر الإشعاع بشكل سلبي علي القدرة الإنزيمة لل ب ي24 وذلك لأن البلاسميد المشععة معروفه بضعف قدرتها التعبيرية. كما تأثرت القدرة الإنزيمية لمستخلص ال ب ي 24 بالتركيزات الضئيلة من أملاح المعادن وذلك بسبب التغيرات التوافقية بالبروتينات اللاتي تحدث عند تعرضها لأملاح المعادن مما يأثر علي قدرتها الإنزيمية بالسلب.
أختبرت السمية الخلوية لمستخلص ال ب ي 24 علي خلايا سرطانية مختلفة منها خلايا سرطان الثدي و الكلي و الميلانوما و اللوكيميا و أظهرت تركيزات مثبطة ل 50% لنمو الخلايا اقل من 10 ميليغرام لكل مل ذات دلالة إحصائية قيمة. وتشير تلك النتايح علي القدرة الجيدة ال ب ي 24 المضادة للسرطان. ليس ذلك فحسب بل عند تركيز 10 ميليغرام لكل مل لم تتأثر خلايا الفم الطبيعية بسميته مما يشير إلي فعاليته و امانه. عند دمج الباكليتكسال مع مستخلص ال ب ي 24 لوحظ خفض ملحوظ بالتركيز المثبط ل 50%لنمو الخلايا علي خلايا سرطان الكبد والثدي و ذلك لزيادة تركيز ال ب ي 24 بالخلايا بعد التعرض للبكليتكسال. في حين, تعارض دمج العلاج الإشعاعي مع ب ي24 علي خلايا الكبد السرطانية و ادي إلي أرتفاع بقيمة التركيز المثبط ل 50%لنمو الخلايا .