الفهرس 
General IntroductionOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 330 |  |  |
| | | from | 330 | | |
Abstract
تشمل استراتيجيات علاج السرطان الجراحة والعلاج الاشعاعي و العلاج الكيميائي وحديثا تم استخدام تقنيات اخري بشكل تدريجي مثل العلاج الجيني والهرموني بالإضافة الي العلاج المناعي ويعد الاوكساليبلاتين احد امثلة العقارات المستخدمة في العلاج الكيميائي للسرطان والذي يعمل عن طريق تحفيز الموت المناعي للخلايا ويعرف الموت المناعي للخلايا علي انه احد العمليات التي يتم فيها تحفيز الاستجابة المناعية الالتهابية في مواجهة الأورام وقد اثبتت الدراسات السابقة ان زراعة خلايا سرطانيه عولجت سابقا بأحد محفزات الموت المناعي للخلايا يؤدي الي الحماية من الإصابة بنفس الخلايا السرطانية كما ان العلاج الموضعي للورم بمحفزات الموت المناعي للخلايا يؤدى الى تضاءل الورم مما يثبت تحفيز المناعة ضد هذا النوع من السرطان .
يتميز الموت المناعي للخلايا بوجود علامات معينه تدل علي حدوثه من أهمها زيادة كمية الكالريتكولين والجزيئات المرتبطة بتكسير الخلايا DAMPs”” وبروتينات الصدمة الحرارية ” HSPs” وكذلك ادينوزين ثلاثي فوسفات ”ATP” وأيضا مجموعة الجزيئات ” HMGB1” ذات القدرة الحركية العالية حيث يقوم الكالريتكولين بالارتباط ببروتين ”CD91” علي سطح خلايا البلاعم كإشارة بمعني قم ابتلاعي كما تمثل ”DAMPs” إشارات للخلايا المناعية بمعني اوجد مكاني وتقوم جزيئات ” HMGB1” بالمساعدة في نمو خلايا ” APCs” وهي الخلايا التي تظهر انتجن (مولد المضاد) وتقود كل تلك الاحداث المتلاحقة الي تحفيز مناعة الجسم .
يعد عقار اوكساليبلاتين احد اهم العقارات المحتوية علي البلاتين والتي تستخدم في العلاج الكيميائي للسرطان عن طريق تقليل انقسام الحمض النووي DNAحيث انه يستخدم في علاج سرطان القولون والبنكرياس والمعدة والمبيض و المثانة و الثدي و الرئة و الرقبة . الى جانب استعمال عقار اوكساليبلاتين كعلاج كيميائى للسرطان الا أنه وجد أيضا انه قادر على تحفيز الجهاز المناعى للجسم فى مكافحاه خلايا السرطان عن طريق تحفيزه لموت الخلايا السرطانيه مناعيا. الا انه كباقي العقارات يعاني من بعض الاثار الجانبية مثل التهابات الاعصاب وانخفاض تعداد الدم و مرض عسر الحس وتعزي اثاره الجانبية الي توزيعه الحيوي الغير محدد في الأنسجة السليمة بعيدا عن موطن المرض وبالتالي دعت الحاجه الي وضع اوكساليبلاتين داخل حامل ادويه مناسب لتعزيز اقتحامه لأنسجة السرطان وبعيدا عن الانسجة السليمة .
و بالإضافة الى ذلك يعد CD44 احد اهم بروتينات الخلية الذي يقوم بأدوار هامه بين الخلايا والوسط المحيط وحيث انه ينتج بكثرة من خلايا السرطان فان له دورا بارزا في نمو السرطان وانتشاره ومقاومته للعلاج الكيميائي وبالتالي فان تقليل انتاج هذا البروتين باستخدام الاجسام المضادة او siRNA او غيرها قد يساعد في تحسن التأثير العلاجي للبروتوكول المستخدم وفي هذا السياق تعد جسيمات أكسيد الخارصين النانوية “nZnO” ذات التأثير المضاد للبكتريا والفيروسات والسرطان والتي لها ايضا تأثير واضح علي التحفيز المناعي عن طريق تأثيرها علي CD44 مما يمكنها ان يكون لها دور قوي في مكافحة السرطان .
تعتبر تقنية النانو الاداة الاكثر بروزا في تطوير حاملات الادوية حيث توفر تطبيقات إكلينيكية متعددة الاستخدامات وتوسع نطاق الإنتاج الصناعي و تعد الجسيمات النانوية البوليمرية والناقلات النانوية الدهنية هي الأنواع التي تم دراستها بشكل رئيسي و تمت الموافقة عليها من قبل منظمة الغذاء والدواء الأمريكيه للتطبيقات السريرية.
و يتم تقسيم الاستهداف الدوائي إلى إستراتيجيات استهداف سلبية ونشطة و يعتمد الاستهداف السلبي للسرطان على انتاج جسيمات نانوية يمكنها النفاذ من خلال اغشية السرطان ذات النفاذية التي يتراوح قطرها من 300 إلى 4700 نانومتر علاوة على ذلك، فان ضعف التصريف اللمفاوي في الأورام بسبب خلل في تكوين الأوعية اللمفاوية وضغط الأوعية اللمفاوية عن طريق تكاثر الخلايا السرطانية و هي الظاهرة المسماة تعزيز النفاذية وتأثير الاحتفاظ داخل النسيج .
وفي هذا السياق فان هذه الدراسة هدفت الي تحميل الاوكساليبلاتين وجسيمات الخارصين النانوية ” nZnO ” داخل جسيمات الالبيومين النانوية بهدف تحسين دخولها الي الخلايا وزيادة السمية الخلوية والقدرة علي القضاء علي الخلايا السرطانية )موت الخلايا المبرمج( بالإضافة الي تقييم تأثير استخدام غشاء كرات الدم الحمراء للجسيمات النانوية المكونة في المختبر و داخل الجسم الحى ودراسة فاعليتها في التحفيز المناعي ضد خلايا سرطان القولون.
ولتحقيق هذا الهدف فقد انقسمت الدراسة الي ثلاثة فصول:
الأول: تحضير ودراسة جسيمات أكسيد الخارصين النانوية ( nZnO ) .
الثاني: تحضير ودراسة جسيمات الالبيومين النانوية المحملة بعقار الاوكساليبلاتين واكسيد الخارصين والمغطاة بغشاء من كرات الدم الحمراء.
الثالث: دراسات حيوية ومناعية لجسيمات الالبيومين النانوية المحملة بعقار الاوكساليبلاتين واكسيد الخارصين والمغطاة بغشاء من كرات الدم الحمراء.
الفصل الأول: تحضير ودراسة جسيمات الخارصين النانوية ” nZnO ”
في هذا الفصل كان الهدف هو تحضير nZnO باقل حجم ممكن لتستخدم كعلاج مناعي مساعد للسرطان وتم ذلك عن طريق دراستين كانت الاولي دراسة اوليه هدفت الي دراسة تأثير الوقت ودرجة الحرارة علي حجم الجسيمات النانوية ثم هدفت الدراسة التالية الي دراسة تأثير تركيز المادة البادئة وهي نترات الخارصين والاس الهيدروجيني بالإضافة الي سرعة التقليب علي حجم بلورات nZnO .
تم تحضير الجسيمات المذكورة انفا بطريقة الترسيب الكيميائي من خلال الاستعانة ببرامج الجودة بالتصميم وقد وجد ان زيادة تركيز نترات الخارصين او سرعة التقليب من شانها تقليل الحجم بينما يزداد بزيادة قلوية المحلول وقد تم تحضير الصيغة المثلي باستخدام 500 مللي مول من نترات الخارصين واس هيدروجيني 10 وسرعة تقليب تساوي 1000 لفه في الدقيقة وبدراسة تركيب البلورات الناتجة وجد انها ذات شكل سداسي يتسق تماما مع ما تم تحضيره سابقا في دراسات اخري.
وبدراسة خواص الصيغة المثلي عن طريق التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء واشعة اكس تم التأكد من اتساق نتائج التحليلات المختلفة مع ما تم قياسه من حجم البلورات مما يؤكد نجاح طريقة الترسيب الكيميائي في تحضير بلورات nZnO وقد تم أيضا دراسة الشحنة السطحية للبلورات المتكونة وقد وجد انها تتراوح بين +25.32 ±3.21 الي 18.78± 1.58 اعتمادا علي وسط القياس وفي النهاية تمت دراسة اطلاق ايونات الخارصين من الجسيمات المتكونة والتي وجد انها تزداد بزيادة حمضية وسط الاطلاق في الفصل التالي جرت محاولات من اجل التحميل المشترك لجسيمات النانو أكسيد خارصين مع الاوكساليبلاتين داخل جسيمات الالبيومين النانوية المغلفة بكرات الدم الحمراء .
الفصل الثاني
تحضير وتوصيف جسيمات الالبيومين النانوية المحملة بالاوكساليبلاتين وجسيمات nZnO ذات غشاء كرات الدم الحمراء
أثبتت الجسيمات النانوية المكونة أساسا من الالبيومين نجاحها كمنصة لعلاج السرطان كما انه يعتقد ان توفر منصة حامله لأكثر من عقار قد يؤدي الي تحسن المردود العلاجي لمرضي السرطان ومن المثير للاهتمام أن إدارة الغذاء والدواء الأمريكية قد وافقت على nZnO كمنصة متعددة الوظائف قادرة على مكافحة أنواع مختلفة من السرطان مع تحقيق مهام متعددة حيث انه يمكن أن يُعزى النشاط المضاد للسرطان لها إلى قدرتها على اطلاق شقوق الأكسجين المتفاعلة واستقطاب البلاعم الذي يعزز موت الخلايا المبرمج للسرطان بالإضافة إلى تثبيط CD44 الذي يعوق التصاق السرطان والهجرة الي انسجة اخري داخل الجسم كما ان استخدام طبقة الغشاء الطبيعي المشتق من كرات الدم الحمراء سيضيف العديد من المزايا مثل التوافق الحيوي ، وعدم استثارة المناعة في موجود عقار مثل الاوكساليبلاتين وبالتالي في هذا الفصل تم تحضير اغشية كريات الدم الحمراء المغلفة للالبيومين المحتوي على أوكساليبلاتين و nZnO وتقييمها باستخدام أربع دراسات :
1- تحديد نسبة المذيب إلى المذاب ووقت التقليب لتركيبة أوكساليبلاتين الألبومين النانوية 2- دراسة العوامل المؤثرة علي حجم جسيمات الالبيومين النانوية وكفاءة التحميل للعقار بداخلها 3-التحميل المشترك لتركيزات مختلفة من nZnO مع عقار اكساليبلاتين داخل جسيمات الالبيومين النانوية 4- إضافة غشاء كرات الدم الحمراء للصيغة المثالية المحملة ب nZnOبالإضافة لاوكساليبلاتين داخل جسيمات الالبيومين النانوية .
في البداية تم تحضير جسيمات الالبيومين النانوية المحملة بالعقار باستخدام تقنية تقليل الاذابة وباستخدام برامج الجودة بالتصميم و تم دراسة تأثير العوامل المختلفة التي يمكن ان تؤثر علي حجم جسيمات الالبيومين وتحميل العقار بداخلها وقد وجد بالدراسة ان زيادة كمية الالبيومين وتركيز أوكساليبلاتين ادي إلى زيادة حجم الجسيمات ونسبة تحميل أوكساليبلاتين ، بينما أدت زيادة سرعة التقليب إلى تقليل كلا الاستجابتين وبناءا علي نتائج الدراسات المختلفة فقد وجد ان الصيغة المثلي تتكون من البيومين بتركيز (5 mg/mL)واكساليبلاتين بتركيز (3 mg/mL) مع سرعه تقليب 1000 لفه في الدقيقة .
و تمت دراسة تحميل nZnO داخل جسيمات الالبيومين النانوية لزيادة الفاعلية ضد السرطان وقد وجد باستخدام طرق التحليل المختلفة ان التركيز المناسب استخدامه من nZnO هو 20% بالنسبة لتركيز الالبيومين وهو ما يحقق زيادة غير كبيرة في الحجم وانخفاض غير مؤثر في تحميل عقار الاوكساليبلاتين حيث وجد ان حجم الجسيمات الجديدة حوالي 131± 3.61 نانومتر بينما نسبة تحميل العقار 81.65± 1.01% وقد تمت دراسة كفاءة ارتباط nZnO بالالبيومين بطرق التحليل المختلفة واثبات حدوثها وقد اثبت التحليل السطحي تحول شكل جسيمات الالبيومين من الشكل الكروي الي شكل الدونات نتيجة وجود nZnO.
ثم تأتى المرحلة التالية من البحث والتي تم فيها تغطية الجسيمات السابقة بأغشية كرات الدم الحمراء والذي ادي إلي زيادة طفيفة في الحجم قدرت ب 8 نانومتر وهو ما يكافئ سمك غلاف كرات الدم الحمراء ولم يحدث تأثير يذكر على نسبة تحميل العقار او nZnO الا ان التأثير كان واضحا على كفاءة التحميل بانخفاضها من 7.99 ± 1.15% الي 4.85± 0.26%. وهو ما حدث نتيجة زيادة وزن الصيغة المحضرة.
وفي سياق متصل كان من المهم التأكد من وضع غشاء كرات الدم الحمراء والتحامها بشكل سليم علي سطح جسيمات الالبيومين النانوية وتم ذلك بحساب النسبة المئوية لجليكوبروتين وحمض سياليك بالإضافة الي CD47 السطحي وقد وجد ان اغشية كرات الدم الحمراء قد احتفظت بنجاح بمعظم محتواها من المكونات الثلاثة وقد وجد أيضا ان تغطية الجسيمات بأغشية كرات الدم الحمراء لا يؤثر تأثيرا ملموسا على ثباتها لمدة كافيه وعدم حدوث تغيرات في حجم الجسيمات او نسبة تحميل العقارات بداخلها بمرور الوقت.
أخيرا تم دراسة إطلاق الاوكساليبلاتين و Zn+2 من الصيغة المحضرة باختلاف الوسط متعادل او حمضي (ليشبه الوسط داخل خلايا السرطان) وقد وجد ان معدل الاطلاق يزداد في الوسط الحمضي لكليهما بينما يصبح ابطا نتيجة وجود غشاء كرات الدم الحمراء كما كشفت دراسات الاستقرار للصيغة المحضرة بعد التخزين لمدة 21 يومًا عند 4 درجات مئوية عن تغييرات غير مهمة في الخصائص الفيزيائية والكيميائية المقاسة.
مما سبق اتضح ان النتائج المذكورة أعلاه قد أعطت منطقًا للتقييم المناعي و الحيوي للصيغة المحضرة.
.
الفصل الثالث
دراسات حيوية ومناعية على جسيمات الالبيومين المحملة بالنانو أكسيد خارصين مع اكساليبلاتين والمغطاة بأغشية كرات الدم الحمراء
في هذا الفصل تم تكوين الصيغة المذكورة انفا والتي رمز اليها ب C-AlbOxa-nZnO وتم دراسة دخولها الي خلايا البلاعم وخلايا السرطان CT26بالإضافة الي التحفيز المناعي من خلال زيادة الكالريتكولين وATPوHMGB1 كما تم فحص كفاءة البلعمة في المختبر ضد الخلايا السرطانية المعالجة مسبقًا مع الأنظمة المثلي المحضرة سابقا كما تم أيضًا فحص تأثير C-AlbOxa-nZnO على انتاجCD44 وبالتالي التصاق الخلية والقدرة على الهجرة على خلايا CT26 وفي نفس السياق تم أيضًا تقييم التوزيع الحيوي في الجسم الحي لC-AlbOxa-nZnO في الفئران الحاملة للورم.
وقد أظهرت C-AlbOxa-nZnO (المكونة من 5 ملغ من البيومين و 3 ملغ أوكساليبلاتين و 1 ملغ nZnO والمغلفة بكرات الدم الحمراء) زيادة بمقدار 2 ضعف في السمية الخلوية مقارنة بمحلول الدواء الحر بالإضافة الي انها زادت بشكل ملحوظ من علامات موت الخلايا المبرمج CT26 وهي caspase 3 و 7 اكثر من الخلايا غير المعالجة أو تلك المعالجة باستخدام C-AlbOxa أو C-AlbnZnO.
تم ايضا تقييم امتصاص البلاعم لكل من AlbOxa-nZnO المغلف وغير المغلف بأغشية كرات الدم الحمراء من حيث النوعية والكمية بواسطة مجهر الليزر متحد البؤر وقياس التدفق الخلوي وقد كان غلاف كرات الدم الحمراء (RBcs) قادرًا على تقليل استيعاب البلاعم للنظام المقترح ومن الجدير بالذكر ان تم أيضًا فحص امتصاص C-AlbOxa-nZnO بواسطة خلايا CT26 نوعياً وكمياً بواسطة مجهر الليزر متحد البؤر وقياس التدفق الخلوي وقد كشفت الرسوم البيانية المجهرية عن امتصاص C-AlbOxa-nZnداخل الخلايا بشكل أفضل.
وقد تم تحسين الالتقام الخلوي في خلايا CT26بشكل يعتمد على الوقت والتركيز وبتتبع مسارات الالتقام الممكنه اتضح ان الالتقام الخلوي تم بوساطة الكلاثرين ووجد انه هو المسار الصحيح المتضمن في امتصاص C-AlbOxa-nZnOالمحضره.
ومن الجدير بالذكر أيضا انه كان وجود nZnOكان مسؤولاً عن تقليل كميةCD44 السطحي وبالتالي إعاقة كل من التصاق الخلية والهجرة وأيضا كان C-AlbOxa-nZnO قادرًا على تحفيز استقطاب البلاعم نحو نمط البلاعم M1المقاوم للسرطان من خلال زيادة IL-6 وTNF-α وCD80 و CD86 و MHC II على خلايا البلاعم J774.
و بالإضافة الى ذلك قان C-AlbOxa-nZnO كانت قادرًة في خلايا CT26علي زيادة الكالريتيكولين السطحي، وإطلاق ATP و HMGB1 وايضا قادرة على تحفيز تعرف البلاعم والبلعمة لخلايا CT26 المعالجة اكثرمن الخلايا غير المعالجة ونتيجة لذلك فقد لوحظ تراكم أعلى داخل نسيج الورم بعد إعطاء C-AlbOxa-nZnO عن طريق الوريد مقارنة بالنظير غير المغلف بغشاء كرات الدم الحمراء.
و وفقًا لذلك، يمكن اعتبار C-AlbOxa-nZnO نظامًا نانويًا واعدًا محتملًا يحفز الاستجابات المناعية المضادة للورم ، وبالتالي ، يمكن استخدامه كنظام توصيل قابل للحقن مع تأثير طويل الأمد ، وإطلاق متحكم فيه للأوكساليبلاتين وتوجه للورم ولدعم نتائج هذه الدراسة ، يبدو أنه من الضروري إجراء المزيد من دراسات فعالية مضادات الأورام ودراسات استخدامها ضد أنواع مختلفة من السرطان .