الفهرس 
IntroductionOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 162 |  |  |
| | | from | 162 | | |
Abstract
لتعريف الجزيئى والسيرولوجى لفيروس الروتا المعزول من السيرم والبراز
في السنوات الأخيرة، تم الاعتراف بأن الفيروسات هي من اهم المسببات للأمراض التي تنقلها الأغذية الملوثة بمياه الصرف الصحي ، فهناك أكثر من 12 عائلة من الفيروسات تنتقل إلى البشر عن طريق تناول الطعام الملوث. من هذه العائلات عائلة Reoviridiae ، والتي تضم مجموعة من الفيروسات المعوية وهذه الفيروسات لا تتكاثر في الأغذية ، ولكن تلوث الأغذية وتنقل العدوى.
تم الكشف عن أعداد كبيرة من الجزيئات الفيروسية في براز الأشخاص المصابين بأعراض مرضية أو بدون أعراض مرضية . و عدد قليل من الجسيمات الفيروسية المعدية (أقل من 100) تسبب العدوى وحدوث المرض . الفيروسات المعوية تقاوم الضغوط البيئية ، بما في ذلك الحرارة والحموضة . ومعظم الفيروسات المعوية ثابتة عند الرقم الهيدروجيني 3.0 ومقاومة للمذيبات الدهنية ومتحملة التجميد والتجفيف.
يهدف البحث إلى الكشف عن فيروس الروتا وعزله وتحديد هويته وكذلك الأنماط الجينية المنتشرة في مصر وينتقل عن طريق عن طريق الأغذية.
ولتحقيق الهدف تم جمع 70 عينة براز و 30 عينة بلازما تم جمع عينات البراز من الأطفال الذين عانوا من الإسهال الحاد من مستشفيات و المختبرات الطبية مختلفة تابعة لمحافظات القليوبية والقاهرة. وتم تركيز هذه العينات عن طريق الطرد المركزي . تم الكشف عن انتيجينات فيروس الروتا في عينات البراز المركزة بواسطة ILFST ، ELISA و الأجسام المضادة لفيروس Rotavirus فى عينات السيرم بواسطة ELISA. استُخدم اختبار شريط التدفق المناعي السريع (ILFST) للكشف عن فيروس الروتا في عينات البراز المركز والبلازما من مرضى الأطفال والنساء والرجال الذين تم جمعهم من مواقع مختلفة. وكانت العينة الإيجابية عبارة عن خط بلون وردي متميز في مناطق الاختبار ، بالإضافة إلى خط وردي في منطقة خط التحكم على الشريط المناعي واظهرت النتائج ان عدد عينات البراز. 41 اعطت نتيجة موجبة من أصل 70 مع معدل الإصابة 58.6 ٪ في حين ، 5 من 15 البلازما سجلت معدل الأجسام المضادة 33.3 ٪. على العكس من ذلك ، لم يتم الكشف عن انتيجينات فيروس الروتا في عينات السيرم المركزة . وكان اعلى معدل اصابة بين الااطفال سجلت ينسبة 69.0 فى البراز و44.4 % فى السيرم يليهم النساء ينسبة 46.7 فى البراز و11.1 % فى السيرم تم الرجال ينسبة 38 فى البراز ولم يتم الكشف عنه فى السيرم
استخدام الاختبارالمناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) للكشف عن فيروس الروتا في عينات البراز والبلازما للأطفال والمرضى من الرجال والنساء الذين تم جمعهم من موقع مختلف. و التفاعل الإيجابي إذا تجاوزت الكثافة البصرية الطول الموجى لعينة الاختبار تلك القيمة المقطوعة ؛ ≥ 0.24. أظهرت النتائج ان 57 العينة الإيجابية من 70عينة يراز ينسبة 81.4 %. و8 العينة الإيجابية من 15عينة سيرم ينسبة 53.3 % . وكان اعلى معدل اصابة بين الااطفال سجلت ينسبة 88.1 % فى البراز و77.8 % فى السيرم يليهم النساء ينسبة 80 % فى البراز و11.1 % فى السيرم . تم الرجال ينسبة 61.5 فى البراز ولم يتم الكشف عنه فى السيرم و أظهرت النتائج ان اختبار ELISA أكثر كفاءة من الفحص عن اختبار ILFST لفيروس الروتا المكتشف فى التقييم الكمي والنوعي لفيروس الروتا .
الخصائص البيولوجية لفيروس الروتا:
أظهرت زراعة البراز المركزالتى اظهرت نتيجة إيجابية مع الأجسام المضادة المتخصصة من انتيجينات فيروس الروتا على الخلايا فيرو أحادي الطبقة البلاكات مختلفة في الشكل والحجم والعدد. كما أشارت النتائج إلى وجود فيروس الروتا في عينات البلازما والبراز وقراءة تركيزات مختلفة في خلية فيرو مثل 120x105 and 95x106PFU/ml على التوالى.
معايرة فيروس الروتا : تم حساب معيارة فيروس الروتا كوحدات تشكل البلاك (PFU \ ml) على خط الخلية من الخلايا فيرو أحادي الطبقة . كان عيار الفيروس 5.5x107; 6.0x106 and 7.5x107(PFU\ml). 120x105 and 95x106PFU/ml التوالي بعد4 أيام بعد الإصابة.
المجهر الإلكتروني النافذ : أظهر جزيئات فيروسة عديدة الاوجة فى الخلية المصابة بطريقة الصبغ السالب باستخدام حمض الفوسفوتونجستيك بواسطة المجهر الإلكتروني . ارتبطت عدوى فيروس الروتا بسلسلة من التغييرات المرضية شبه الخلوية التي أدت إلى تحلل الخلايا خلال 24 ساعة من التحضين. ولوحظ أيضا تكثيف فى البروتوبلازم وتحطيم الكروماتين ، وخلايا عملاقة ( متعدت الاتوية) . جزيئات الفيروسات غير المغلفة. ولوحظ أيضًا في السيتوبلازم حويصلات في أحجام مختلفة صغيرة إلى كبيرة في خلايا فيرو المصابة. تم تحضينها من يوم إلى سبعة أيام بعد الخلايا التي دمرها فيروس الروتا.
الخصائص الجزيئية لفيروس الروتا :
تم استخراج الرنا المزدوج الجديلة من خط خلية من Vero . تم تأكيد نقاوة الحمض النووي الريبي المنقى بواسطة مقياس الطيف بالأشعة فوق البنفسجية 1.5 ، 1.4 ، 1.6 ، 11.4 ، 0.7 و 0.6 عند 260/280 نسبة OD. كان تركيز الحمض النووي الريبي 75 ، 54 ، 64 ، 53 ، 15 ، و 24 ميكروغرام لـ Chs ، Chp و Wp و Mp Ws و Ms على التوالي.
انتاج DNA) - ( RNA cDNA : تم نسخ الحمض النووي الريبي الفيروسى المنقى الناتج من عينات البراز والبلازما إلى الحمض النووي اوكسى ريبوز ( دنا ) باستخدام انزيم النسخ العكسى RT وبادئ التكميلي (العكسي ، VP6-R 5’-GTGAAAACGCGTTGCAAGTT-3 ’).
تضخيم الحمض النووي دنا المكمل :. تم تضخيم الحمض النووي لـ DNA - RNA بواسطة تقنية PCR باستخدام خليط التفاعل RT-PCR والبادئات المحددة. الجينات VP6 وعن طريق الفصل الكهربائى لتحليل ناتج ال PCR باستخدام 1.5 ٪ الاجاروز جيل. كان الحمض النووي المتضخم بالحجم المتوقع محسوبا ≈.300bp.
تم تنقية ناتج ال PCR لجين vp6 لعزلات RV من الاجاروز جيل باستخدام كيت استخراج الحمض النووي الهلامي. سمح Amplicons تشكيل PCR لتسلسل رد الفعل من خلال طريقة تسلسل دورة الآلي . كان التسلسل الذي تم الحصول عليه لكل كتاب تمهيدي لكل عزلة كافٍ فوق رمية الكرة بينهما واستخدم لتكوين تسلسل مستمر واحد (Contag). تسلسلات النيوكليوتيدات الجزئية (231 bp) من جينات vp6 DNA لـ RV ، تم إجراء التطابق للعزلات لتحديد العلاقة مع العزلات الأخرى المسجلة في بنك الجينات العام .
تحليل التتابع النيكلوتيدى على أساس التطابق المتعددة التتابعات : تمت مقارنة التتابع النيكلوتيدى لعزلات الفيروس مع العزلات الأخرى المسجّلة على بنك الجينات Genbank باستخدام مبرمجي DNAMAN و MEGA.4 (ويسكونسن ، ماديسون ، الولايات المتحدة الأمريكية) . تم عرض التطابق المتعددة التسلسل (MSA) التي تشغل فيها النيوكليوتيدات المقابلة سلالة KU317471 / EGYPT / G8P14. تظهر محاذاة الجينات المتعددة المواقع المحفوظة والنسبة المئوية للحفظ لكل موقع . تشترك عزلات الفيروس مع العزلات الأخرى فى التطابق المتعددة التسلسل في الأصل التطوري وتشابه التسلسل إلى حد ما. و وتطابق تسلسل الأحماض الأمينية المتعددة للتتابع النيكلوتيدى لجين vp6 فيروس الروتا.
تحليل التسلسل على أساس شجرة النشوء والتطور: بناءً على تحليل التطابق المتعددة التتابعات (MSA) ، تم عمل شجرة النشوء والتطور وأظهرت أربع مجموعات تضم عزلات فيروس الروتا Egy. أظهر متماثل مع KC412050.1 (الأرجنتيني ، سلالة) ؛