الفهرس 
ReviewOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 157 |  |  |
| | | from | 157 | | |
Abstract
تعد العدوى بديدان الهيمونكس كونتورتس من الأمراض الطفيلية الأكثر تدميرا وإنتشارا بين القطعان والتي تؤثر على إنتاجية الأغنام، و تسبب معدلات مرتفعة للاصابة والوفيات في مزارع الأغنام فى مصر. تعتمد الطرق التقليدية للتشخيص على فحص عينات براز الحيوان للتعرف على نوع البويضات واستكمالها بمزرعة اليرقات. ويعيب هذه الطريقة أنها لاتعطى تشخيص دقيق للإصابة بالطفيل وخصوصا فى حالات الإصابة فى مراحلها الأولى وكذلك المزمنة وقلة عدد البويضات فى البراز. ولذلك هدفت هذه الدراسة إلى تشخيص الإصابة بهذا الطفيل عن طريق التشخيص المناعى بإختبار الإدمصاص المناعى الإنزيمى (الإليزا) كطريقة دقيقة ومساعدة فى التشخيص بإستخدام مولدات ضد مختلفة تم تحضيرها من الديدان البالغة، اليرقات و المنتجات المخرجة والمفرزة، بالإضافة إلى أن هذه الدراسة ألقت الضوء على الجوانب الأساسية لعلم الجينوم للديدان موضع الدراسة عن طريق استخلاص وتضخيم ومعرفة تتابع القواعد الوراثية لكل من انترنال ترانسكربد سباسر 2 ITS-2))النووى وسيتوكروم أوكسيديز وان جين (COI gene) فى الميتوكوندريا لدراسة الوراثة العشائرية الخاصة بأنواع الهيمونكس مما يؤدي إلى معرفة واسعة بتوزيع وإنتشار هذه الطفيليات واشتملت الدراسة على ثلاث مراحل هى:المرحلة التحضيرية وفيها يتم تجميع العينات ، تحضير مولدات الضد (الانتيجينات)، إنتاج الأجسام المضادة فى الأرانب، والتحليل البروتينى بتقنية الفصل الكهربائى بإستخدام البولى اكريلاميد جيل.المرحلة التشخيصية من خلال إختبار الإدمصاص المناعى الإنزيمى و التي تمكن من تقييم حساسية ودقة مولدات الضد المختلفة المحضرة للكشف على الأجسام المضادة الخاصة بالحيوانات المصابة بالديدان تجريبيا واستخدام مولد الضد الأكثر حساسية للكشف على الأجسام المضادة الخاصة بالحيوانات المصابة بالديدان حقليا بالإضافة إلى تحديد المكونات المناعيةبه باستخدام تقنية الطبع المناعى. مرحلة التوصيف الجينى لتقييم الإنسياب الجينى واحتمالية الطفرات اعتمادا على دراسة التتابع النيوكليتدى لجين سيتوكروم أوكسديزوان فى الميتوكوندريا وجين انترنال ترانسكربد سباسر2 النووى.تم تحضير مولدات الضد المختلفة فى صورتها الخام كمستخلص الديدان البالغة و مستخلص الطور اليرقى الثالث و مستخلص المنتجات المخرجة والمفرزة أو فى صورها المنقاة جزيئيا أو كليا كالبروتين المحور وراثيا 26/23 وتقيمها باستخدام تقنية الفصل الكهربى فى البولى أكريلاميد جل. وقد نتج عن التنقية الجزئية لمولدات الضد المختلفة المحضرة من ديدان الهيمونكس كونتورتس عند فصلها باستخدام مادة السفاديكس درجة 100 فى أعمدة الفصل الكروماتوجرافية ثلاث وحدات كروماتوجرافية من مستخلص الديدان البالغة و مستخلص الطور اليرقى الثالث ووحدتين فقط من مستخلص المنتجات المخرجة والمفرزة. وأظهرت نتائج الفصل الكهربى أن هناك إختلافات ملحوظة بين الحزم البروتينية لمولدات الضد المختلفة المحضرة من الهيمونكس كونتورتس. وبتحليل هذه النتائج ثبت أن هناك أربع حزم بروتينية مشتركة وزنها الجزيئى 43، 60 كيلو دالتون بالنسبة لمولدات الضد المحضرة من الديدان البالغة، بينما حزمة بروتينية وزنها الجزيئى 66 كيلو دالتون بالنسبة لمولدات الضد المحضرة من الطور اليرقى الثالث، وأيضا حزمتين مشتركتين فقط عند 15، 24 كيلو دالتون من مولدات الضد المحضرة من المنتجات المخرجة والمفرزة. وأوضحت الدراسة حزمة بروتينية واضحة وزنها الجزيئى 26 بالنسبة لمولد الضد المحور وراثيا 26/23.ووفقا لنتائج الإليزا فى العدوى التجريبية فإن كلا من الجزء الأول لمولد الضد المنقى جزئيا من الديدان البالغة ومولد الضد المحور وراثيا 26/23 يبدوان أكثر حساسية من مولدات الضد الآخرى فى الكشف عن الأجسام المناعية المضادة مع اختلاف واضح في مستوى الأجسام المضادة بين الأمصال الإيجابية والسلبية المخلقة حتى فى أقل تخفيف لهما 1:12800، وأيضا أثبت كلا من الجزئين الأول والتانى لمولد الضد المنقى جزئيا من الديدان البالغة فاعلية فى الكشف المبكر عن الإصابة حتى قبل ظهور الأعراض الإكلينيكية بعد أول أسبوع من الإصابة التجريبية. وبذلك يكون الجزء الأول لمولد الضد المنقى جزئيا من الديدان البالغة هو أفضل مولد ضد ويمكن إستخدامه فى تشخيص الإصابة تحت الظروف الحقلية للكشف عن الحالات تحت الإكلينيكية والعدوى الحديثة.وقد أجريت الدراسة التشخيصية باستخدام الأليزا بواسطة الجزء الأول لمولد الضد المنقى جزئيا من الديدان البالغة على أمصال ثمانمائة وثمانون من الأغنام للكشف عن الأجسام المناعية المضادة بها بالمقارنة بوجود الديدان البالغة فى معدتها الرابعة. وأوضحت النتائج أن 12.36% من الأغنام المفحوصة احتوت معدتها الرابعة على ديدان الهيمونكس كونتورتس، فى حين تم الكشف عن 42.61% حالات إيجابية بإستخدام الأليزا. فيما خلصت النتائج أن الجزء الأول لمولد الضد المنقى جزئيا من الديدان البالغة بلغت درجة حساسيته 97.24% ، بينما درجته التخصصية 65.11% ، كما قدرت نسبة النتائج الإيجابية المتوقعة ب 28.26% ، ونسبة النتائج السلبية المتوقعة 99.4% ، وكانت القيمة التشخيصية له 69.09٪. وأظهرت النتائج أن هناك تفاعلية مناعية للجزء الأول لمولد الضد المنقى جزئيا من الديدان البالغة مع أمصال الأجسام المضادة للمونيزيا حتى تركيز 1:800، بينما لم تتم أى تفاعلية مناعية ضد أمصال الأجسام المضادة للفاشيولا حتى مع تركيز 1:50. على النحو الآخر أظهر مولد الضد الخام المحضر من الديدان البالغة تفاعلية مع أمصال الأجسام المضادة للمونيزيا حتى أعلى تخفيف 1:3200، ومع أمصال الأجسام المضادة للفاشيولا حتى تركيز 1:200.وفيما يتعلق بالطبع المناعى للجزء الأول لمولد الضد المنقى جزئيا من الديدان البالغة ضد الأمصال المختلفة (الأمصال فوق مناعية المحضرة فى الأرانب ضد كلا من مولد الضد المنقى جزئيا من الديدان البالغة، المونيزيا والفاشيولا وكذلك أمصال الحيوانات المصابة طبيعيا وتجريبيا بالهيمونكوزس وأمصال خالية من الأجسام المضادة للإصابة فى الأرانب والأغنام) تم التعرف على ست حزم بروتينية يتراوح وزنها الجزيئى ما بين 11.8-18.3، 23.0-26.0، 45.0-63.4، 78.6-93.7، 102.5-105.5، 120.6- 153.8 كحزم بروتينية مشتركة في حين أن اثنين من المركبات البروتينية حول 23 و 26 كيلو دالتون كانت أكثر الحزم شيوعا وخصوصية للإصابة.وفيما يخص الدراسة الجزيئية تم تجميع ذكور ديدان الهيمونكس كونتورتس من ثلاث مجازر مختلفة بهدف تضخيم انترنال ترانسكربد سباسر 2 (ITS-2) الخاص بالمادة الوراثية الريبوسومية للنواة باستخدام تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل ومن ثم معرفة التتابع النيوكليتدى له. والذى أنتج حزمة جينية قدر طولها 231 قاعدة نيتروجينية و سجل في بنك الجينات مع رقم التسجيل ( KF176320 ). وبدراسة الإختلافات فى تسلسل النيوكليتدات والتنوعات الجينية داخل العشائر أظهرت النتائج أن هناك طرزا جينيا واحدا لديدان الهيمونكس فى مصر المعزولة من الأغنام من الثلاث مناطق حيث أن لها نفس النمط الجينى ولا وجود لأى إختلافات وراثية مما يشير إلى حركة العائل المكثفة داخل مصر. وأظهرت النتائج أيضا تشابها بنسبة 99.6 % مع HQ844231 ، KC998714 ، JQ342246 و JN128898 بنسبة إختلاف 0.4 % فى حين وصلت نسب التشابه إلى أدنى درجاتها 98.3 % مع EU084684 بنسبة إختلاف 0.9 %. وأوضحت مقارنة التتابع النيوكلوتيدى للعزلة المصرية مع عزلات من دول أخرى اختلافات طفيفة شملت عدم التطابق فى ثلاث قواعد. ولذلك فإن نتائج هذه الدراسة يمكن أن يكون لها مردودا على التوصيف السريع والدراسات الوبائية للهيمونكس والديدان الآخرى فى مصر.وقد سجلت الدراسة توزيع أنواع الهيمونكس والتنوع الجينى بها والتركيبة الجينية السكانية للعشائر بين العوائل المختلفة عن طريق تضخيم جين سيتوكروم أوكسديز وان ((COI الموجود فى المادة الوراثية للميتوكوندريا والذى أنتج حزمة جينية طولها 709 قاعدة نيتروجينية وسجل فى بنك الجينات بأرقام تسجيلKT826575 ، KT826574 ، KT826572 و KT826573 للأغنام والماعز والأبقار والإبل على التوالى. وبتحليل تسلسل النيوكليوتيدات وجد أن هذه التتابعات تنتمى إلى الهيمونكس كونتورتس فى عزلات الأغنام والماعز والأبقار بينما إلى الهيمونكس لونجستبس فى عزلات الإبل. وتعتبر هذه الدراسة هى الأولى التى تثبت وراثيا إصابة الإبل المصرية بالهيمونكس لونجستبس. وكان محتوى G+C فى تتابعات عزلات الأغنام والماعز والإبقار والإبل 32 % ، 31.2 % ، 35.1 % و 32.8 % على التوالى. وكانت أعلى نسبة تشابه (93.5%) بين عزلة الأغنام والماعز بنسبة تباين 4.4 %. وكانت أقل نسبة تشابه (80.2 %) بين عزلة الأغنام والإبل مع إختلافات وصلت إلى 21.9 %. وأظهرت شجرة النشوء والتطور أن عزلات الأغنام والماعز والأبقار لها نفس الأصول الوراثية مما يعنى أن هناك ارتفاعا فى معدلات تدفق الجينات ما بين العشائر ،وبين العوائل المختلفة وذلك نتيجة للتربية المختلطة والمكثفة بينها. على النقيض فإن الهيمونكس لونجستبس المعزولة من الإبل المصرية أظهرت أقل تناظرا مع الهيمونكس كونتورتس وأكثر تمييزا دون التواجد فى مجموعة واحدة مع المضيفين الآخرين فى تحليل النشوء والتطور. وتمت مقارنة العزلات المصرية مع عزلات الهيمونكس من بلدان أخرى لتوضيح التركيبة الجينية للعشيرة الذى أثبت أن العزلات المصرية أظهرت تشابها مع العزلات الباكستانية ولها نفس الأصول فى تحليل النشوء والتطور. ومن وجهة النظر فإن هذه الدراسة ستساهم فى تغير الاستراتيجيات المستخدمة للحد من انتشار هذا الطفيل.الخلاصةوقد خلصت الدراسة إلى:1.أفضلية الجزء الأول لمولد الضد المنقى جزئيا من الديدان البالغة فى التشخيص المناعى والكشف عن الأجسام المضادة في مصل الأغنام المصابة على المستوى التجريبى والحقلى.2.توافر البروتين المناعى حول 23 و 26 كيلو دالتون فى الجزء الأول لمولد الضد المنقى جزئيا من الديدان البالغة عن طريق الطبع المناعى والذى استخدم كمولد ضد محورا وراثيا (rhcp 26/23).3.الحكم على التداخلات التفاعلية الخاصة بالجزء الأول لمولد الضد المنقى جزئيا من الديدان البالغة عن طريق الأليزا والطبع المناعى أثبتا بأن التدخلات التفاعلية بين الديدان سببا رئيسا فى تقليص الخصوصية فى التشخيص.4.معرفة التتابع النيوكليتدى لجين انترنال ترانسكربد سباسر 2 (ITS-2)النووى وفر أساسا سليما لتحديد نوع ديدان الهيمونكس من الديدان البالغة.5.إمكانية التوصيف الوراثى وتقييم ظاهرة التحور الجينى وأنماط إنسياب الجينات لأنواع الهيمونكس المعزولة من الحيوانات المختلفة اعتمادا على دراسة التتابع النيوكليتدى لجين سيتوكروم أوكسديز وان(COI) بجانب معرفة النمط الجينى.التوصيات1.فاعلية الجزء الأول لمولد الضد المنقى جزئيا من الديدان البالغة عن طريق تقنية الأليزا غير المباشرة كوسيلة سيرولوجية وتشخيصية وبديلة للطرق التقليدية لتشخيص الهيمونكس كونتورتس.2.التشخيص الجزيئى باستخدام جين انترنال ترانسكربد سباسر 2 والذى يمكن أن يستخدم بشكل مباشر فى تشخيص الهيمونكوزس فى الماشية.3.التقنية الجزيئية توفر بعض المزايا فى تحديد أنواع الديدان بالمقارنة بتلك القائمة على الشكل الظاهرى حيث انها أكثر موضوعية، أسهل في التنفيذ مع التوصيف السريع لأنواع الهيمونكس.